本法參照國標GB 4789. 3-2010規定的大腸菌群測定方法第二法。
⒈檢驗程序見(jiàn)圖3-7
⒉原理
樣品先經(jīng)過(guò)VRBA瓊脂平板的篩選，因其中含有膽鹽和結晶紫，可以很好的抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)，乳糖可以產(chǎn)酸，在中性紅存在時(shí)，產(chǎn)生典型的紫紅色周?chē)屑t色膽鹽沉淀的菌落。因為其他陰性腸桿菌可以分解其他糖類(lèi)產(chǎn)生紅色菌落，因此需接種BGLB培養基證實(shí)。
⒊操作步驟
樣品處理及稀釋同MPN法。
①加樣制作平板：選取2-3個(gè)適宜的連續稀釋度，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿ImL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對照。及時(shí)將15 -20mL冷至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注．于每個(gè)平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3～ 4mL VRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置于（36±1)0C培養18~24h.
②平板菌落數的選擇：選取菌落數在15 ~150CFU的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0. 5mm或更大。
③證實(shí)試驗：從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內，(36±1)℃培養24-48h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽(yáng)性。
④大腸菌群平板計數的報告：經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以8. 3中計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每克（每毫升）樣品中大腸菌群數。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數為：100 X 6/10 X 10-4 CFU/g(mL)＝6. 0 X 10一3 CFU/g（mL)。
⒋檢驗時(shí)應注意的事項
①檢驗步驟
2008版前的大腸菌群的檢驗步驟采用三步法（乳糖膽鹽發(fā)酵試驗、EMB瓊脂分離培養和證實(shí)試驗）。第一步乳糖發(fā)酵實(shí)驗是樣品的發(fā)酵結果，不是純菌的發(fā)酵試驗，所以初發(fā)酵陽(yáng)性管，經(jīng)過(guò)平板分離和證實(shí)試驗后，有時(shí)可以成為陰性。大量的數據表明，食品中大腸菌群檢驗步序的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗相差較大，不同食品三步法的符合情況也不一致，所以2008版之后改為兩步法，取消了分離培養這一步，將大腸菌群MPN計數法的培養基由乳糖膽鹽修改為月桂基硫酸鹽胰蛋白膝肉湯；復發(fā)酵培養基由乳糖發(fā)酵肉湯改為亮綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯，大腸菌群MPN法中報告每100mL (100g）改為1mL(1g)。試驗證實(shí)，修改后對大腸菌群的檢出效果相同，發(fā)酵管對于陽(yáng)性結果的判斷只通過(guò)“產(chǎn)氣”，不存在顏色的影響，明確了判斷依據；減少了步驟，使操作更加簡(jiǎn)便，結果更接近真實(shí)。
②產(chǎn)酸產(chǎn)氣原因：在初發(fā)酵試驗中，能出現產(chǎn)酸產(chǎn)氣現象的原因很多，如大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；兩種細菌共同作用發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但其中任何一種不能單獨發(fā)酵；食品中雜菌多時(shí)，（多黏芽抱桿菌、浸麻芽抱桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌）發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；有些非大腸菌群發(fā)酵葡萄糖等糖類(lèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣。因此必須做證實(shí)試驗。
③復發(fā)酵結果：從LST產(chǎn)氣管接一環(huán)到BGLB中進(jìn)行復發(fā)酵，（此時(shí)不受樣品中非乳糖的干擾進(jìn)行乳糖發(fā)酵，也避免了許多芽抱桿菌的干擾），在BGLB中產(chǎn)氣的為陽(yáng)性，不產(chǎn)氣的為陰性。但此法也有缺陷，有時(shí)出現假陽(yáng)性。由于亮綠遇膽鹽降低了其活性，有時(shí)不能徹底抑制芽抱菌。為避免此缺陷，對BGLB中產(chǎn)氣的劃線(xiàn)于EMB上，挑典型菌落鏡檢。
④抑菌劑：在大腸菌群檢驗中，經(jīng)常使用的抑菌劑有膽鹽、洗衣粉、十二烷基磺酸鈉、亮綠、結晶紫、孔雀綠等。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群的生長(cháng)和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱(chēng)量時(shí)稍有誤差，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響；有的抑菌劑當牌號、規格改變時(shí)，也可影響抑菌效果，而需重新測定抑菌的有效劑量，這些情況均給抑菌劑的使用帶來(lái)不利條件。目前我國在食品大腸菌群檢驗方面采用膽鹽作為抑菌劑，豬、牛、羊三種膽鹽對大腸菌群的檢驗效果，經(jīng)試驗觀(guān)察無(wú)明顯差異，可相互替代，但其他膽鹽的檢驗效果則不一致，故不宜相互替代。
目前由于膽鹽不易購買(mǎi)，有的實(shí)驗室以3號膽鹽、混合膽鹽、去氧膽酸鈉、兔膽鹽等替代豬膽鹽加入培養基中，這會(huì )影響大腸菌群的檢驗結果，應予注意。因此在2008版的檢驗標準中改為月桂基硫酸鈉。兩者的作用都是抑制革蘭氏陽(yáng)性球菌。但前者是化學(xué)試劑，批間差異小，易觀(guān)察結果，對損傷菌有修復作用，檢出率提高，檢驗結果穩定。后者是生物試劑，取自牛和豬等動(dòng)物的膽囊，批間差異大，結果可靠性差。另外，在膽鹽用量上實(shí)驗表明1%, 0.5％和0. 25％三個(gè)劑量無(wú)任何差異，所以目前乳糖發(fā)酵管采用的膽鹽劑量（(0. 5%)是適宜的，在稱(chēng)量時(shí)稍有誤差，亦不致影響大腸菌群的檢出。
⑤平板計數法：若樣品較臟，使用MPN法較不方便，一般使用結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）在平皿內樣品稀釋液與VRBA瓊脂混合，等到凝固后，另加蓋一層VRBA瓊脂，以抑制專(zhuān)性需氧菌，從中挑取粉紅暈的菌落計數，取30~150個(gè)菌落的平板，挑選其中10個(gè)有代表性的菌落分別接種到亮綠膽鹽發(fā)酵管進(jìn)行鑒定。
⑥挑選菌落：大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱(chēng)，大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸埃希氏菌類(lèi)更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。所以在實(shí)際工作中，為了提高大腸菌群的檢出率，應當熟悉大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在檢驗中，大腸菌群在VRBA瓊脂上典型菌落呈紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0. 5mm或更大。在伊紅一美藍（EMB)平板上的菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤的檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。菌落形態(tài)的其他方面（如菌落大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、降起度、濕潤與干燥等）雖亦應注意，但不如色澤方面更為重要。影響大腸菌群檢出率的因素較多，如食品種類(lèi)、菌落色擇和形態(tài)、細菌種類(lèi)等，所以實(shí)際工作中通常挑選一個(gè)菌落，由于概率問(wèn)題，難免出現假陰性，尤其當菌落不典型時(shí)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無(wú)典型菌落則多挑幾個(gè)，以免出假陰性。
⑦產(chǎn)氣量：大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可使發(fā)酵倒管全部充滿(mǎn)氣體，少者可以產(chǎn)生小于米粒的氣泡。一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關(guān)，但隨樣品種類(lèi)而不同，有小于米粒的氣泡，亦可有陽(yáng)性檢出。對未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問(wèn)時(shí)，可用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應做進(jìn)一步觀(guān)察。這種情況的陽(yáng)性檢出率可達半數以上。
⑧MPN法：MPN法是一種采用數學(xué)理論推算，用置信區間描述細菌濃度的一種間接計數法。雖然實(shí)驗結果以MPN值表示，但MPN值并不能表示實(shí)際菌落數，而實(shí)際菌落數落在置信區間內的任何一點(diǎn)。該方法是1915年McCrady首次發(fā)表的。
最可能數（MPN）是表示樣品中活菌密度的估測。MPN檢索表通常是采用三個(gè)稀釋度九管法來(lái)計算的，當然也可以十五管或更多。稀釋度的選擇是基于對樣品中菌數的估測，較理想的結果應是最低稀釋度3管為陽(yáng)性，而最高稀釋度的3管為陰性。如果無(wú)法估測樣品中的菌數，則做一定范圍的稀釋度。這次提供的MPN檢索表列出了95％可信限，供作參考。
另外，在查閱MPN檢索表時(shí)，應注意以下幾不問(wèn)題。
通常MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，即0.1mL(g), 0.O1mL(g), 0.OO1mL(g)，如欲改用1mL(g)、0. 1mL(g)、0. 01mL(g）或0. 01mL(g)、0. 001mL(g)、0. 0001mL(g）時(shí)，則表內數字應相應增加或降低10倍，其余可類(lèi)推。
在MPN檢索表第一欄陽(yáng)性管數下面列出的mL (g)，系指原樣品（包括液體和固體）的毫升（克）數，并非樣品稀釋后的毫升（克）數，如固體樣品lg經(jīng)10倍稀釋后，雖加人1mL量，但實(shí)際其中只含0. 1 g樣品，故應按0. 1g計，不應按1mL計，或按1mL計，單檢索數字必須再乘以稀釋倍數。
當檢索表內三個(gè)稀釋度檢測結果都是陰性時(shí)，MPN值應按＜3判定，這樣更能反映實(shí)際情況。例如11. 1mL(g）和1. 11mL(g）兩個(gè)檢測劑量，當它們都是陰性時(shí)，如按。處理，則兩組樣品雖相差10倍，但MPN值卻無(wú)法區分，實(shí)際上這兩個(gè)。的含義并不相等。如按照＜3和＜30處理，則MPN值能反映出兩組所用樣品量的不同，實(shí)際上11. 1mL(g）應為G3，而1. 11mL(g）應為＜30，二者還是有區別的。所以用＜3和＜30處理，更能反映實(shí)際情況。
